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细胞存储

细胞冷冻保存的方法

1.材料:

生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII) 


2、冷冻保存方法:  
(1)传统方法: 冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16~18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。  -20℃不可超过1小时,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。  
(2)程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1~-3℃/分钟之速度由室温降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。  

3、步骤:  
(1)冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。  
(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):另取一离心管,加入培养基、血清,逐滴加入二甲基亚砜(DMSO)至20%浓度,即制成双倍的冻存液,置于室温下待用。  

(3)离心收集培养之细胞,用加血清的培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。 

(4)取与细胞悬液等量的冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管,制成细胞冻存悬液(DMSO最后浓度为5~10%),使细胞浓度为1~5×106 cells/ml,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1~2ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后,注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。  


4、注意事项:  
(1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态,约为80~90%致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
(2)细胞在液氮中可长期冻存无限时间,而不会影响细胞活力;在-70度可保存数月。  
(3)注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品,如Sigma D-2650),以5~10ml小体积分装,4℃避光保存,勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液,可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗,可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化,可换用10%甘油冻存。  
(4)冷冻保存之细胞浓度:  
①normal human fibroblast:1~3×106 cells/ml  
②hybridoma:1~3×106 cells/ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。 
③adherent tumor lines:5~7×106 ,依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度,而HeLa只需1~3×106 cells/ml  
④other suspensions:5~10×106 cells/ml,human lymphocyte须至少5×106 cells/ml。  
(5)冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个backup culture,以防止冷冻失败。  
(6)冻存可用10%~90%的血清,一般高浓度血清有助于维护细胞活力,此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积(4度时),复苏存活率在80%~90%以上,对原代培养细胞,以90%血清冻存更为有效。