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间充质干细胞MSC细胞冻存方法指导

如何冻存间充质干细胞是我们在培养细胞时必然会遇到的,一般我们培养出细胞后无论是实验还是临床细胞必然不可能一次性用完并且还需要保留样本,在保存细胞时就一定需要冻存。那么该如何对细胞进行冻存呢,在冻存细胞时又有哪些问题是需要注意的呢?下面就给大家来详细的介绍一下关于细胞冻存的整个步骤指导。

1、细胞悬液的制备

(1)按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物,制备单细胞悬液,并计算细胞总数;

(2)将细胞悬液以800~1000r/min 离心5min,去上清液;

(3)向细胞沉淀物中加入细胞冻存液,轻轻吹打混匀,使细胞密度达1×106~1×107个/ml ;

(4)按每管0.5-1ml 的量分装于冻存管内,拧紧管盖;

(5)在冻存管上做好标记,包括细胞名称、代次及冻存日期等内容。

2、冻存

为保持细胞最大存活率,冻存时要遵循“慢冻快融”的原则。标准的降温速度是1-2℃/min ,当温度到达 -25℃,降温速度可加快至5-10℃/min,到-80℃可直接入液氮。

分级冷冻

(1)先将冻存管放入普通冰箱冷藏室(4~8℃),约30min;

(2)接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室(-10℃~-20℃),约1-2 小时;

(3)然后将冻存管转移到超低温冰箱(-70℃~-80℃),过夜;

(4)最后将冻存管投入液氮中保存。

降温过程也可使用专为细胞冻存设计的程序冷冻仪,我们采用的是将冻存管放入冻存盒里,再放入-80℃过夜,由于聚氯乙烯导热比较慢,所以温度可慢慢降下来,次日可直接放入液氮罐。这样可以保证细胞的活力不受到温度变化速率的影响。

3在冻存时需要注意的问题:在使用DMSO前,不能进行高压灭菌,因其本身就有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构,以致降低冷冻保护效果。也不能使用普通的砜类材料的过滤膜来进行过滤。在常温下,DMSO对人体有毒,故在配制时最好带手套。冻存液最好现用现配。在将细胞冻存管投入液氮时,操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋,动作要小心、轻巧,以免液氮从液氮罐内溅出,对皮肤造成冻伤。应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力,还要确保无微生物污染,这样的细胞才具有冻存价值。另外,在每批细胞冻存一段时间后,可复苏1~2 管,以观察其活力以及是否受到微生物的污染。冻存管宜采用塑料冻存管,不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时,需要从-196℃的液氮中取出冻存管,立即投入37~40℃温水中,温差很大,玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。