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细胞存储

细胞计数与存活测试

1、原理:  
(1)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。  
(2)血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber中细刻9个1mm2 大正方形,其中4个角落之正方形再细刻16个小格,深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1mm2 ×0.1mm=1.0x10-4 ml。使用时,计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104 ,即为每ml中之细胞数目。  
(3)存活测试之步骤为dyeexclusion,利用染料会渗入死细胞中而呈色,而活细胞因细胞膜完整,染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料,如果细胞不易吸收trypan blue,则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率:活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成,随时间延长,部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力,用不含血清的稀释液,可以使染色计数更为准确。 

 2、材料:  0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061);Erythosin bluish stain;取0.1gram Erythrosin  bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip);计数器(counter);低倍倒立显微镜;粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液(4%乙酸溶液)。 

 3、步骤:  
(1)取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。 
(2)取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入,盖上盖玻片,于100倍倒立显微镜下观察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。  
(3)计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypanblue等体积混合),最后乘以104 ,即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上,只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。  注:4大格细胞总数×稀释倍数×104 /4=细胞数/ml;每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4 ml